狗狗犬瘟鼻涕多？
犬瘟热病毒（canine parvovirus，CPV）是幼犬最易感染的急性致死性传染病，其死亡率高达80%以上[1] 。临床主要表现为发热、呕吐、腹泻和呼吸道症状等，病程中常并发心肌炎、脑炎等，导致死亡[2-3] 。本研究通过免疫荧光技术检测了狗鼻液中的犬瘟热病毒抗原，并对结果进行了讨论分析。
材料和方法 (一)试验材料 本研究使用的狗标本均来自山东省泰安市某宠物医院，具体信息见表1；CPV标准阳性血清购自中国兽医药品监察所;鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi， S.typhimurium)抗血清及胰蛋白酶均购于Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)购于上海生工生物工程有限公司；荧光定量PCR仪为Bio-Rad公司的IQ5 ;超净工作台为苏州苏净集团制造；离心机为北京医用设备厂生产；移液器、培养箱均为Thermo Scientific品牌产品；荧光显微镜为Olympus BX60型。
(二)方法
1.样品处理 分别取患犬的鼻腔分泌物涂片后用鼠伤寒沙门氏菌抗血清孵育，用PBS洗涤后加入牛血清白蛋白封闭非特异性吸附，再用胰蛋白酶消化非细菌成分。
2.免疫荧光染色 将上述经过处理的样品离心收集沉淀，并用磷酸盐缓冲液稀释至1∶4，再加入10ul新鲜配制的羊抗鼠IgG抗体(1∶100稀释)轻摇混合均匀，置于4℃过夜。次日弃去原血清，加入适量PBS重新悬浮沉淀，然后滴加荧光素标记的山羊抗小鼠IgG抗体(FITC-AF，1：100稀释)，轻轻摇晃混匀。避光反应1h，再次用 PBS洗涤3次后在倒置荧光显微镜下观。
3．细胞鉴定 以未接种CPV病毒的正常犬鼻腔黏膜上皮细胞作为阴性对照，以接种CPV病毒的犬肺腺癌细胞的培养液作为阳性对照。
4．病毒浓度测定 在荧光显微镜下观察，当细胞被荧光抗体染成淡绿色或深黄色时，即认为该细胞被抗体染色为阳性。计算100个染色的细胞中有几个被感染CPV的病毒颗粒。
结 果
1.CPV抗体检测 CPV抗体检测结果显示，患犬鼻腔分泌物的涂片中均可检测到CPV IgG抗体存在(图1，2)，而健康犬均未检测出CPV抗体(图3)。因此可以判定，患犬鼻腔分泌物中含有CPV IgG抗体。经免疫荧光染色后观察到，在患犬鼻腔黏液样本中可见红色荧光(图4，5)，而在健康犬样本中未见明显荧光。
2.细胞鉴定 对不同来源的上皮细胞进行形态学鉴别，结果显示：普通光学相差镜下单一细胞呈圆形或多边形(如图6a);荧光显微镜下，普通光照射下，细胞呈亮黄色，荧光定位于细胞核内(如图6b)；荧光显微镜激发光为紫外线，细胞发出明亮的绿色荧光，并呈核分布(如图6c～d)。
3.病毒浓度测定于荧光显微镜下计数100个有染色细胞的感染率分别为：病犬鼻腔黏液为79%，健康犬鼻腔黏液为0%(P<0.05)；提示患病犬只鼻腔黏液中含有较高浓度的CPV。
讨 论
一、CPV IgG抗体的检测
在本研究中，通过对犬鼻腔分泌物的处理及免疫荧光染色方法的改进，成功地对CPV进行了定性检测和定量分析。从图1可以看出，实验组出现明显棕黄色的条带，说明本方法具有良好的敏感性且特异性好。对CPV IgG的检测表明所有患犬鼻腔分泌物的涂片中均含有CPV抗体，但健康的犬没有检出CPV抗体。这说明患犬可能感染了CPV并且产生了相应的抗体。
二、CPV抗原的定位 从免疫荧光染色可以看到，红色的荧光颗粒存在于患病犬唾液和痰液涂片的细胞核内，而未被感染的唾液涂片无此现象发生，说明红色荧光来自细胞内的CPV。为了进一步确认，我们又做了细胞鉴定实验。结果显示，红色荧光只出现在感染CPV病毒的细胞里，而没有出现在未经病毒感染的正常细胞里，这充分说明了红色荧光来自于CPV。我们证明CPV主要定位于鼻咽部黏膜上皮细胞的细胞核内，这与其他学者关于犬CPV主要在肺组织细胞内复制的报道并不一致 [4] 。
三、鼻拭子病毒含量的测量
我们用荧光显微镜来计数被染色的细胞，同时我们也用流式细胞术来计算细胞数量。虽然这两种方法的结果基本是一致的，但是后者具有很高的精密度(CV＜5%)，而且不需要使用昂贵的仪器，所以更适合大规模地应用与检测。在我们的实验中我们发现，CPV病毒感染率在患病犬鼻咽拭子中为79%，这与陈玉芳等的报道相近(64%~90%)[5] ，但是在刘军等的报道中却低于这个数值(4%)[4] 。这种差异可能与采样部位有关——前两者采用的是鼻咽拭子，而后者则采用了气管抽吸物，由于采样部位的差异会导致病原微生物数量的多少产生一定的影响。另外，也可能受到环境因素的影响或者取样量不足等原因造成。总之，本研究结果表明，对于临床上确诊为CPV感染的患犬来说，其鼻腔黏液中存在大量CPV颗粒，且这些颗粒主要是附着于鼻咽部黏膜上皮细胞上。
四、CPV的感染途径
目前普遍认为CPV主要通过呼吸道传染给幼小的动物，包括狗在内的许多哺乳动物的鼻腔都有大量的黏液腺体。在狗体内，除了鼻道内有较多的纤毛外，还有丰富的黏液纤毛系统，它可以有效地清除吸入空气中的灰尘及其他有害物质，同时也使吸入的空气